Leer una columna que sangra

La columna ideal de los libros de texto baja con tres bandas redondas, separadas, cada una de un color distinto, y se recoge en cinco fracciones. Eso no pasa nunca. Una columna real es una conversación con la sílice y con tu muestra; lo que ves bajar te dice qué está pasando si sabes leerlo. Con los años uno deja de mirar la columna como un aparato de producción y empieza a verla como un instrumento de diagnóstico. Lo que sale por abajo importa, sí, pero a veces lo que importa más es lo que no sale.

Una columna que sangra, en la jerga, es una columna que tira producto sin parar, fracción tras fracción, sin un máximo claro. Es la imagen más común y más equivocadamente aceptada de una columna fallida. La gente la tira y empieza otra. Pero antes de tirarla conviene preguntarse por qué sangra; la respuesta está casi siempre en uno de cuatro sitios.

El TLC predice y miente

Toda columna empieza en una placa de TLC. Cargas tu mezcla, eluyes con un sistema, miras dónde van las manchas, calculas un Rf y eliges la fase móvil. Es lo correcto. También es donde se producen los autoengaños más bonitos.

El primer error es confundir Rf con resolución. Dos manchas con Rf de 0.30 y 0.45 en TLC no son automáticamente separables en columna. La placa es un sistema cerrado y corto; la columna es largo y abierto. Si las manchas son borrosas o si una arrastra cola, la columna va a comportarse mucho peor que la placa, no mejor.

El segundo error es elegir un Rf demasiado alto. La regla práctica es eluir el producto con un sistema en el que su Rf esté entre 0.20 y 0.35. Por debajo de 0.15 la columna sangra durante horas; por encima de 0.40 el producto co-eluye con todo lo apolar y se pierde la separación. Si en la placa todo va con Rf de 0.6, no estás listo para columna; estás listo para diluir.

El tercer error es no revelar bien la placa. Una mancha invisible bajo UV, que aparece tras revelar con vainillina o ácido fosfomolíbdico, es producto. Si solo miras UV, te perderás los tioésteres, los azúcares, las aminas largas, la mitad de tus impurezas. Conviene tener al menos dos reveladores: uno general —el fosfomolíbdico es brutal pero universal— y uno selectivo según la química —ninhidrina para aminas, anisaldehído para azúcares y terpenos¹.

La banda que se ensancha

Una banda que entra estrecha en la columna y sale ancha, abarcando diez fracciones cuando esperabas tres, casi siempre te dice una de tres cosas.

Primero, que la columna está mal empaquetada. Si la sílice tiene burbujas, regiones de distinta densidad o canales preferenciales, el frente del eluyente avanza desigual y la banda se difunde. La forma de evitarlo es empaquetar siempre en húmedo —preparar una papilla de sílice en el disolvente de salida y verterla a velocidad constante mientras se bombea o se aplica presión—, y nunca dejar que la columna se seque entre etapas. Un secado parcial introduce aire y el aire mata la separación.

Segundo, que la sílice ha absorbido humedad. La sílice de bote es higroscópica y, en un laboratorio donde llueve mucho o el aire acondicionado falla, pierde calidad rápido. La sílice mojada tiene capacidad reducida y bandas anchas. La solución, fea pero eficaz, es activar la sílice en estufa a 120 °C durante un par de horas antes de columnas críticas. La que está mucho tiempo abierta en un saco al borde del laboratorio es prácticamente inútil para separaciones finas.

Tercero, y el más sutil: la cantidad de muestra excede la capacidad de la columna. La regla aproximada es una proporción masa de sílice : masa de muestra de 50:1 para separaciones fáciles —ΔRf mayor de 0.2—, y de 200:1 o más para las difíciles. Sobrecargada, la sílice satura sus sitios polares y la muestra se mueve más rápido y más ancha, todo a la vez. Si la banda sale ensanchada y antes de lo que predice el TLC, casi seguro hay sobrecarga.

La banda que se parte en dos

Bajan dos picos del producto, separados por un par de fracciones, cuando el TLC mostraba uno solo. Es desconcertante y hay tres causas habituales.

La primera es que tu producto no es uno solo. Diastereómeros, rotámeros lentos, tautómeros que solo se separan en condiciones cromatográficas: cosas que el TLC no resuelve y la columna sí. Es buena noticia disfrazada de mala. Conviene recoger las dos fracciones por separado, hacer RMN de ambas y comparar; si los espectros son iguales, son rotámeros o tautómeros y van a equilibrarse en disolución. Si son distintos, has separado algo y deberías saber qué.

La segunda es que la muestra está parcialmente descomponiéndose en la sílice. La sílice es ácida —su pH superficial efectivo está cerca de 4.5— y degrada cosas sensibles a ácido: cetales, acetales, algunas aminas terciarias en forma de sales, BOC sobre nitrógenos primarios delicados. El producto entra entero y sale parcialmente desprotegido. La firma del problema: una banda que aparece con cada nueva inyección, y otra que aparece como impureza nueva sin estar en el TLC original².

La tercera, menos común pero real, es que la columna esté sucia de una corrida anterior. Un residuo apolar de un trabajo previo en la cabeza de una columna recién montada puede emigrar con tu eluyente y sumarse a tu producto, dando una banda doble. Por eso el material crítico se hace en columnas vírgenes.

La banda que se queda pegada arriba

Cargas la muestra, abres el grifo, eluyes con el sistema previsto y los primeros centímetros del lecho se quedan teñidos. La banda no avanza. Eluyes con sistema más polar y nada. Subes a 1:1 y nada. ¿Qué pasa?

Cuatro hipótesis, en orden de probabilidad.

El producto es muy polar para tu sistema. A veces uno se obstina en bajar un compuesto con grupos hidroxilo libres usando hexano/acetato, sin darse cuenta de que necesita acetato puro o, mejor, acetato/metanol al 5 %. La pista la dan los grupos funcionales y un poco de TLC iterativo: prueba sistemas más polares en placa antes de poner los huevos en una columna.

Pero ojo: subir bruscamente la polaridad en una columna ya en marcha es una receta para el desastre. La banda baja pegada al frente, llega abajo en cinco minutos junto con todo lo demás, y pierdes la separación. La forma correcta es hacer un gradiente suave —si estabas en 20 % de acetato, sube a 30, luego 40—, dejando varios volúmenes de columna entre cada cambio.

El producto se ha quelado con un metal residual. Pasa con compuestos que llevan iminas, hidroxiquinonas, fosfinas, ditioles. Si has hecho una reacción de paladio o de cobre y la columna no avanza, intenta añadir un poco de trietilamina —1 % en el eluyente— o, en casos extremos, una pizca de EDTA en la sílice. La amina compite por los sitios ácidos del SiO₂ y libera tu producto.

El producto se ha descompuesto al cargarlo. Cargar muestra disuelta en disolvente más polar que el de salida es un error frecuente: el frente de carga lleva la muestra rápido, luego el eluyente menos polar la abandona en la cabeza y empieza a degradarla. La regla es cargar siempre en el disolvente de salida, o un poco menos polar. Si la muestra no se disuelve, cárgala como sólido —disuelta en mucho disolvente, mezclada con dos o tres veces su masa de sílice, evaporada a sequedad y vertida en seco encima de la columna—, no la fuerces.

Tu producto es un alquitrán. A veces no es producto. Es la materia oscura de la reacción —oligómeros, polímeros, productos de descomposición— que se queda pegada porque es heterogénea y muy polar. Una vez que lo aceptas, la columna sirvió: te dijo que la reacción no iba como creías. Buena información, mal momento.

La sílice tiene mala memoria, los disolventes peor

La sílice del proveedor de turno —Merck 60, SDS, Carlo Erba, J.T. Baker— no es exactamente la misma de marca a marca, ni de lote a lote. La distribución de tamaño, el contenido residual de agua, la actividad de la superficie, todo varía. Para una separación sensible, conviene quedarse con un proveedor y un tamaño —40–63 µm es el estándar— y, en lo posible, con el mismo lote durante toda una serie de purificaciones.

El disolvente importa más de lo que parece. El acetato de etilo del bote viejo no es el del bote nuevo: ha absorbido agua, se ha hidrolizado un poco a etanol y ácido acético, ha capturado polvo. Una columna hecha con disolvente recién destilado se comporta distinto a una hecha con disolvente «de lavado». Para el día a día, no destila uno todo, pero conviene saber que un eluyente «raro» puede explicar una columna rara.

El gradiente, además, no es un único sistema sino una sucesión. Si mezclas mal —si echas el menos polar primero y luego el más polar y agitas mal— estás haciendo otra columna distinta a la planeada. La forma sensata es preparar una sola disolución mezclada por completo, no añadir disolvente al frasco entre fracciones.

Cuándo tirar una columna a tiempo

Hay una virtud silenciosa, en este oficio, que es saber cuándo abandonar. La columna que va mal no va a corregirse aunque le añadas un litro más de disolvente; lo que conseguirás es perder más tiempo y más muestra. Las señales de tirar son claras: la banda no avanza tras dos volúmenes de columna del eluyente más polar razonable; el frente sale incoloro durante diez fracciones seguidas; el lecho se ha cuarteado y forma canales visibles; la presión sube sin razón obvia.

En esos casos, la decisión correcta es recoger todo lo que sale en un solo matraz, evaporar, hacer TLC para evaluar pérdidas, y rehacer la columna con condiciones distintas y, si es posible, con sílice nueva. La diferencia entre un químico experimentado y uno que recién empieza no es que el experimentado no falle: es que reconoce el fallo dos horas antes y reacciona.

Coda: la columna como microscopio

Cuando alguien aprende a leer columnas deja de ver la cromatografía como purificación y empieza a verla como caracterización. La forma de las bandas, los Rf reales frente a los predichos, el comportamiento ante un cambio de polaridad, la afinidad por la sílice o por la alúmina —todo eso es información estructural sobre tu compuesto. Una molécula que tira en sílice y se mueve bien en alúmina es una molécula básica. Una que no se mueve en ninguna y necesita un 2 % de trietilamina para bajar tiene varios nitrógenos básicos. Una que se descompone en sílice neutra es sensible a ácido.

La columna no es un detalle del trabajo; es parte del trabajo. Bien hecha, te dice algo que ningún espectro va a decirte solo. Mal hecha, te roba semanas. Vale la pena perder tiempo, sobre todo al principio, mirándola bajar.